La combinazione di micronutrienti inibisce due fasi chiave del contagio da Corona virus (SARS-CoV-2): il legame virale col recettore ACE2 e la sua manifestazione cellulare

 



A. Goc, Ph.D., W. Sumera, M.Sc., Vadim Ivanov, M.D., Ph.D., Aleksandra Niedzwiecki, Ph.D., Matthias Rath, M.D.
Dr. Rath Research Institute, San Jose, CA

 


 

Introduzione

Introduzione: La pandemia da Corona virus rappresenta una sfida senza precedenti per la salute umana e l’economia globale. La ricerca di vaccini ed altri approcci si sono concentrati finora su molecole sintetiche che sono associate ad effetti avversi.

Risultati

micronutrienti può bloccare quasi completamente l’interazione tra il Corona virus e il suo connettore cellulare, il ricettore ACE2. Inoltre, questa composizione è in grado di diminuire significativamente l’espressione del recettore ACE2 nelle cellule epiteliali alveolari (polmoni) di oltre il 90%.

Conclusione

Questo studio fornisce la base per strategie di salute pubblica efficaci e sicure basate su assunzione ottimale di micronutrienti. Inoltre consente alle persone di partecipare attivamente alla prevenzione del Corona virus, in aggiunta a mascherina, distanziamento sociale e altre misure difensive.

 



INTRODUZIONE

 

La rapida diffusione della pandemia del Corona virus (COVID-19) sta minacciando la salute globale, debilitando le economie mondiali e sfidando le generazioni future (Chakraborty 2020). Durante la prima metà del 2020, il COVID ha colpito oltre 16 milioni di persone e causato più di 660.000 morti in tutto il mondo (https://covid19.who.int/).

Sequenziando l’intero genoma del virus (Zhu 2020), è stata identificata una sindrome respiratoria acuta, Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) e la malattia causata da questo virus ha preso appunto il nome di Corona Virus 2019 (COVID-19).

Un altro passo importante verso il contenimento della pandemia è stata l’identificazione della via attraverso la quale la SARS-CoV-2 infetta le cellule del corpo umano. Il virus si lega a recettori specifici sulla superficie delle cellule e successivamente penetra al loro interno e viene trasportato attraverso vescicole (endosomi), raggiungendo il nucleo delle cellule.

Di particolare importanza è il primo passaggio, ovvero il legame del virus al recettore sulla superficie cellulare (Figura 1). Questo meccanismo coinvolge specifiche proteine che si trovano nel virus contenenti un dominio legante del recettore (RBD) che riconosce il suo “sito di ancoraggio”. Questo recettore, chiamato enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2), è una proteina di membrana integrale presente su molte cellule di tutto il corpo e con forte espressione nel cuore, sistema vascolare, sistema gastrointestinale e nei reni, così come nelle cellule alveolari di tipo II dei polmoni. (Li 2003, Hofmann 2005).

Il dominio legante del recettore (RBD) della proteina SARS-CoV-2 si unisce al recettore ACE2. Questo meccanismo è un fattore determinante dell’infettività e dello sviluppo del COVID-19 e un importante fattore per lo sviluppo di vaccini e altre terapie (Du 2009, Du 2017).

In un recente studio, abbiamo dimostrato che una specifica composizione di micronutrienti contenenti vitamina C, alcuni minerali, aminoacidi ed estratti vegetali, è stata efficace nel diminuire significativamente l’espressione cellulare ACE2 nelle cellule colpite dal virus: quelle epiteliali delle piccole vie aeree dei polmoni (alveolari) e quelle endoteliali dei vasi sanguigni (vascolari). Questi micronutrienti sono stati particolarmente efficaci nel ridurre la manifestazione del recettore ACE2 in condizioni infiammatorie, che sono associate al Corona virus e altre infezioni (Ivanov 2020).

Gli importanti risultati di questo studio hanno fatto scattare la domanda se i micronutrienti siano in grado di influenzare anche altri meccanismi delle infezioni da Corona virus, ovvero il legame tra questo e il recettore ACE2. Così, si è mirato a bloccare l’accesso del virus alle cellule umane – lo stesso meccanismo che è ricercato dagli attuali approcci basati su vaccino.

Se i risultati di questo studio fossero positivi, l’umanità avrebbe a disposizione un nuovo approccio naturale e sicuro per controllare efficacemente la pandemia.
Così, nello studio attuale è stata testata un’altra composizione nutritiva, contenente polifenoli e componenti vegetali, su entrambi gli aspetti chiave dell’infettività da SARS-CoV-2 che blocca la manifestazione del recettore ACE2 e, allo stesso tempo, il suo legame con la proteina SARS-CoV-2.

 


 

RISULTATI

Efficacia di una speifica combinazione di micronutrienti sull’espressione ACE2 nelle piccole cellule alveolari epiteliali.

La Figura 1 mostra gli effetti di diverse concentrazioni di vari componenti ed estratti attivi vegetali sull’espressione cellulare dei recettori ACE2 nelle piccole cellule epiteliali alveolari.

I risultati indicano una diminuzione dipendente dalla concentrazione dell’espressione del recettore ACE2 basata su uno specifico legame di anticorpi. Alla più alta concentrazione di 320 ml di nutrienti, l’espressione dei recettori cellulari ACE2 è diminuita del 92%. Ciò indica che in presenza di questi micronutrienti il legame virale con questi recettori può essere sostanzialmente ridotto.

Fig. 2 Effetti della combinazione di micronutrienti sull’espressione dei recettori ACE2 nelle piccole cellule epiteliali alveolari. I cambiamenti dell’espressione dell’ACE2 sono presentati in percentuale di controllo.

L’effetto della combinazione specifica di micronutrienti sul legame della SARS-CoV-2 al ricettore ACE2

Il legame della proteina SARS-CoV-2 al suo recettore cellulare è il fattore chiave dell’acceso alle cellule e all’infettività virale.
E’ stato testato l’ effetto della stessa combinazione di componenti attivi vegetali sul blocco dell’interazione tra la proteina SARS-CoV-2 con il recettore ACE2, attraverso uno screening all’avanguardia che rileva gli inibitori che ne bloccano l’interazione.

Fig 3. Blocco del legame della SARS-CoV-2 al recettore ACE2 da parte di una specifica combinazione di micronutrienti in percentuale di controllo.“Controllo del blocco” = 100% di inibizione del legame”. 

La figura 3 mostra che la combinazione di composti naturali di origine vegetale è in grado di bloccare il legame della proteina SARS-CoV-2 al recettore ACE2. Questo effetto inibitorio è dipendente dalla concentrazione e, attraverso una di 100 ml, si è ottenuto il 97% di inibizione del legame. La sua forte efficacia è stata notata già ad una concentrazione 40 volte inferiore, cioè 2,5 ml, che ha causato circa il 20% di inibizione.

 



DISCUSSIONE

 

Importanza delle nostre scoperte

I risultati presentati in questo studio documentano che i micronutrienti possono inibire fortemente importanti meccanismi cellulari associati all’infezione da Corona virus.
Questi dati giungono in un momento in cui la comunità scientifica globale è alla ricerca disperata di soluzioni efficaci alla pandemia.

Applicando metodologie scientifiche e tecniche all’avanguardia, abbiamo dimostrato che i micronutrienti possono inibire il legame della proteina SARS-CoV-2 al suo recettore specifico ACE2 del 97%. Ciò significa che i micronutrienti potrebbero prevenire quasi completamente l’infettività virale. Inoltre, gli stessi inibiscono l’espressione del recettore ACE2 sulle piccole cellule epiteliali alveolari fino al 92%.

E’ stato inoltre dimostrato che un’altra combinazione di composti naturali tra cui la vitamina C, aminoacidi, componenti vegetali e minerali potrebbe diminuire significativamente l’espressione dei recettori ACE2 su due tipi di cellule principalmente mirate dal virus, ovvero le epiteliali ed endoteliali vascolari (Ivanov 2020).
Altra dimostrazione importante di questo studio è che l’inibizione dell’espressione del recettore ACE2 è ancora più pronunciata in condizioni pro-infiammatorie. Questo implicherebbe che l’efficacia dei micronutrienti sarebbe ancora più pronunciata in stadi avanzati del COVID-19, caratterizzati da infiammazione generalizzata e cosiddetta ‘tempesta di citochine’.

Il presente studio indica che formulazioni specifiche di composti biologicamente attivi di origine vegetale possono essere efficaci nel controllo simultaneo di due meccanismi critici del Corona virus.

Alla luce di queste scoperte, è alquanto sconfortante che gli sforzi scientifici abbiano finora ignorato in larga misura queste prove scientifiche e cliniche. (Jariwalla 2007, Jariwalla 2010, Deryabin 2008, Barbour 2007).

L’evidenza che composti naturali come i micronutrienti potrebbero essere la risposta al Corona virus ed altre pandemie dovrebbe ispirare la comunità scientifica e medica a intraprendere uno sforzo globale per ampliare le conoscenze sul loro valore terapeutico.

Implicazioni di questi risultati per le politiche di salute pubblica

L’entità dell’attuale pandemia e la dimensione dei costi umani ed economici rendono la nostra documentazione un approccio di sanità pubblica convincente.

Ciò è particolarmente importante in quanto tutte le altre misure attualmente sviluppate sono associate a gravi effetti collaterali o sono strategie nuove e non testate. Le reazioni cautelative della comunità internazionale ai primi vaccini, che sono basati su geni virali, testimoniano la consapevolezza dei potenziali rischi.

Sulla base dei risultati del nostro studio, un approccio basato sui micronutrienti diventa disponibile come strategia di salute pubblica efficace – e sicura – per combattere la pandemia. Con una percentuale di blocco di quasi il 100%, i micronutrienti competono con qualsiasi vaccino, senza apportare rischi imprevedibili. Inoltre, questo approccio amplia i potenziali benefici per la salute affrontando altri meccanismi critici associati alle infezioni da Corona virus, diminuendo la disponibilità di “ancoraggi” virali (recettori ACE2) sulla superficie delle cellule umane e supportando il sistema immunitario.

 


 

RIFERIMENTI

  1. Chakraborty I, Maity COVID-19 outbreak: Migration, effects on society, global environment and prevention. Sci Total Environ. 2020; 728: 138882. https://dx.doi.org/10.1016%2Fj.scitotenv.2020.138882
  2. WHO Coronavirus Disease (COVID-19) Dashboard. https://covid19.who.int/. Updated August 13, Accessed August 14, 2020.
  3. Zhu N, Zhang D, Wang W, et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. N. Engl. J. Med. 2020; 382(8): 727-733. doi: 1056/NEJMoa2001017
  4. Li Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins. Annu. Rev. Virol. 2016; 3(1): 237-261. doi:10.1146/annurev-virology-110615-042301
  5. Li W, Moore MJ, Vasilieva N, et al. Angiotensin- converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 2003; 426(6965): 450–454. https://doi.org/10.1038/nature02145
  6. Hofmann H, Pyrc K, van der Hoek L, Geier M, Berkhout B, Pohlmann S. Human coronavirus NL63 employs the severe acute respiratory syndrome coronavirus receptor for cellular entry. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(22):7988– 7993. https://doi.org/10.1073/pnas.0409465102
  7. Du L, He Y, Zhou Y, Liu S, Zheng BJ, Jiang S. The Spike protein of SARS-CoV—A target for vaccine and therapeutic. Nat. Rev. Microbiol. 2009; 7, 226–236. https://doi.org/10.1038/nrmicro2090
  8. Du L, He Y, Zhou Y, Liu S, Zheng BJ, Jiang. MERS-CoV Spike protein: a key target for antivirals. Expert Opin Ther Targets. 2017; 21(2): 131-143. doi:10.1080/14728222.2017.1271415
  9. Ivanov V, Ivanova S, Niedzwiecki A, Rath M. Effective and save global public health strategy to fight the COVID-19 pandemic: Specific micronutrient combination inhibits Coronavirus cell-entry receptor (ACE2) expression. J Cell Med & Nat. Health, 2020.
  10. Jariwalla RJ, Roomi MW, Gangapurkar B, Kalinovsky T, Niedzwiecki A, Rath M. Suppression of influenza A virus nuclear antigen production and neuraminidase activity by a nutrient mixture containing ascorbic acid, green tea extract and amino acids. 2007; 31(1): 1-15. doi: 10.1002/biof.5520310101
  11. Jariwalla R, Gangapurkar B, Pandit A, Kalinovsky T, Niedzwiecki A, Rath M. Micronutrient Cooperation in Suppression of HIV Production in Chronically and Latently Infected Cells. Mol Med 2010; 3(3): 377-85. doi: 10.3892/mmr_00000268.
  12. Deryabin PG, Lvov DK, Botikov AG, et al. Effects of a nutrient mixture on infectious properties of the highly pathogenic strain of avian influenza virus A/H5N1. Biofactors. 2008; 33(2): 85-97. doi: 10.1002/biof.5520330201.
  13. Barbour EK, Rayya EG, Shaib H, et al. Alleviation of histopathological effects of avian influenza  virus by a specific nutrient synergy. International J Appl Res Vet Med. 2007; 5(1): 9-16.

 


 

MATERIALE E METODI

 

Colture cellulari

Le piccole cellule epiteliali delle vie aeree (SAEC, rilevate da ATCC) sono state coltivate in palloni di plastica a 37°C e 5% di CO2. Negli esperimenti SAEC, passaggio 5-7, sono stati placcati a 96 piastre di plastica rivestite di collagene (Corning) in 100 ml di terreno e coltivati per 4-7 giorni per raggiungere lo strato confluente.

Composizione dei micronutrienti

The micronutrient combination used in our experiments was developed at the Dr. Rath Research Institute (San Jose, CA). The test formulation contained: quercetin – 400 mg, cruciferous plant extract – 400 mg, turmeric root extract – 300 mg, green tea extract (80% polyphenols) – 300 mg, and resveratrol – 50 mg.

Integrazione cellulare

La combinazione di micronutrienti è stata sciolta in HCl 0,1N secondo il protocollo della Farmacopea statunitense (USP 2040) e indicata come soluzione principale. Per gli esperimenti le cellule SAEC sono state integrate con dosi di 100 ml per 3-7 giorni.

Saggio ELISA ACE-2

I pozzetti delle piastre di coltura sono stati lavati due volte salina tamponata con fosfato (PBS) e fissati con soluzione di formaldeide al 3%/0,5% di Triton X100/PBS per 1 h a 4°, poi lavati quattro volte con “PBS”. Successivamente, sono stati aggiunti 200 ml di sieroalbumina bovina (BSA, Sigma) all’1% in PBS e la piastra è stata incubata a 4° durante la notte. Gli anticorpi policlonali di coniglio anti ACE2 (Sigma) sono stati aggiunti a 100 ml 1%BSA / PBS per 1.5 h di incubazione a temperatura ambiente. Dopo tre cicli di lavaggio con 0,1% di BSA/PBS, ai pozzetti sono stati aggiunti 100 ml di anticorpi di coniglio IgG coniugati con perossidasi di ravanello (HRP, Sigma) per 1 h a temperatura ambiente. Dopo tre cicli di lavaggio con 0,1% BSA/PBS, l’attività HRP trattenuta è stata determinata mediante incubazione con 100 ml di soluzione di substrato TMB (Sigma) per 20 minuti a temperatura ambiente, seguita dall’aggiunta di 50 ml di 1N H2SO4 e dalla misura della densità ottica a 450 nm con lettore di micropiastre (Dispositivi Molecolari). I risultati sono espressi in percentuale di controllo sperimentale senza aggiunta (media +/- SD, n=6). Il valore medio di controllo non specifico (pozzetti incubati senza anticorpi anti ACE2) è stato sottratto dal valore medio (n=6) di tutti i valori del campione.

Blocco del dominio di legame del recettore

Questo test è stato eseguito utilizzando il kit di neutralizzazione del virus surrogato GenScript SARS-CoV-2 che può rilevare anticorpi e inibitori che bloccano l’interazione tra il recettore RBD e quello di superficie delle cellule ACE2.

Tutti i campioni di test sono stati diluiti con un rapporto di volume 1:9. In provette separate anche l’RBD coniugato con HRP è stato diluito con il tampone di diluizione HRP con un rapporto di volume 1:99.

La reazione di legatura/neutralizzazione è stata effettuata secondo il protocollo del produttore. I controlli diluiti positivi e negativi e i campioni del test alle concentrazioni indicate sono stati mescolati con la soluzione diluita di HRP-RBD in un rapporto di volume 1:1 e incubati a 37° per 30 minuti. Quindi 100 ml della miscela di controllo positivo, negativo e dei campioni in esame sono stati aggiunti ai corrispondenti pozzetti con recettore ACE2 immobilizzato e incubati a 37° per 15 minuti. Le piastre sono state poi lavate quattro volte con 260 ml/pozzetto con soluzione di lavaggio 1x e ad ogni pozzetto è stata aggiunta la soluzione TMB (100 ml/pozzetto).

Le piastre sono state incubate al buio a temperatura ambiente per massimo di 5 minuti. Poi sono stati aggiunti 50 ml/pozzetto di soluzione madre per attenuare la reazione e l’assorbanza è stata misurata immediatamente a 450 nm. L’esperimento è stato eseguito tre volte in maniera duplicata. I valori sono indicati in percentuale di controllo.

Fig 1:

A. Il Corona virus raggiunge le cellule attraverso il recettore ACE2.
B. Principio del kit di prova disponibile in commercio utilizzato in questo studio per misurare l’interazione tra la proteina legante del recettore del Corona virus SARS-CoV-2 e il ricettore ACE2.

 


 

Fonte:

https://www.jcmnh.org/micronutrient-combination-inhibits-two-key-steps-of-coronavirus-sars-cov-2-infection-viral-binding-to-ace2-receptor-and-its-cellular-expression/