INTRODUÇÃO

The rapid spread of the current coronavirus pandemic (COVID-19) is threatening global health, debilitating the economies of the world, and challenging the prosperity of future generations.¹ During the first half of 2020, COVID-19 has affected over 16 million people and caused more than 660,000 deaths worldwide.²

Sequencing the whole genome of a virus from patient samples³, the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) was identified, and the disease caused by this virus was named coronavirus disease 2019 (COVID-19)

Another major step towards curbing the spread of this pandemic was the identification of the pathway by  which SARS-CoV-2 infects the cells of the human body. Coronaviruses first bind to specific receptors on the surface of cells. Subsequently they enter the cells and are carried via transport vesicles (endosomes), ultimately reaching the cell core (nucleus) where their genetic material is incorporated into the DNA of human body cells.⁴

Of particular importance is the first step of the infective pathway, namely the binding of the virus to the receptor on the cell surface (Figure 1). On the part of the coronavirus this binding mechanism involves specific Spike proteins anchored on the surface of the virus containing a receptor-binding domain (RBD) that specifically recognizes its ‘docking site’ – a specific receptor on the surface of the body cells. This receptor, called angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), is an integral membrane protein present on many cells throughout the human body with its strong expression in the heart, vascular system, gastrointestinal system, and kidneys, as well as in type II alveolar cells in the lungs.^5,6

This binding mechanism is the decisive determinant of viral infectivity and the development of the COVID-19. Moreover, it is also a major target for the development of vaccines and other therapeutics.^7,8

While the search for such interventional drugs and vaccines is ongoing, there is a much more direct – and above all safer – way to prevent  this fateful  interaction of coronaviruses with the ACE2 receptor: to suppress the expression of the ACE2 receptors in human body cells so they are no longer available for the anchoring of coronaviruses.

In a recent pioneering study, we were able to show that a specific composition of micronutrients containing vitamin C, certain minerals, amino acids, and plant extracts was effective in significantly decreasing cellular ACE2 expression in key types of cells targeted by the virus: human lung small airways (alveolar) epithelial cells and human blood vessel (vascular) endothelial cells. These micronutrients were particularly effective in down-regulating the ACE2 receptor expression under inflammatory conditions, which are associated with coronavirus and other infections.⁹

The remarkable results of this study triggered the question whether micronutrients are also able to affect other mechanisms essential for coronavirus infections, namely the binding between the virus and the ACE2 receptor. Thus, we aimed at blocking viral entry into human cells – the very same disease mechanism that was selected by essentially all current vaccine-based approaches.

If the results of this study were positive, a new, natural and safe approach would become available to mankind to effectively control the current pandemic.

Thus, in the current study we tested the efficacy of another nutrient composition, containing polyphenols and plant components, on both key aspects of SARS- CoV-2 infectivity: blocking the expression of cellular ACE2 receptor and – at the same time – blocking the binding of a specific SARS-CoV-2 Spike protein to the ACE2 receptor on human cells.

MATERIAL E MÉTODOS

Culturas celulares

As células epiteliais humanas de pequenas vias aéreas (SAECs) da ATCC (American Type Culture Collection) foram cultivadas em meio de crescimento (ATCC) em frascos de plástico a 37°C e 5% de CO2. Para a experiência, as passagens SAECs 5-7 foram revestidas em placas de plástico de 96 poços tratados com colagénio (Corning) em 100 μL meio de crescimento e cultivadas a uma camada celular confluente durante 4-7 dias.

Composição de micronutrientes

A combinação de micronutrientes utilizada foi desenvolvida no Dr. Rath Instituto de Investigação (San Jose, Califórnia). A formulação experimental continha: 400 mg de quercetina, 400 mg de extrato de vegetais crucíferos, 300 mg de extrato de curcuma, 300 mg de extrato de chá verde (80% polifenóis) e 50 mg de resveratrol.

Suplementação celular

A mistura dissolvida em HCl 0,1N de acordo com o protocolo da Farmacopeia dos EUA (USP 2040) foi designada como solução de reserva. Para as experiências de expressão da ACE2, as células foram expostas às concentrações indicadas da combinação de micronutrientes em 100 μL/well no meio de crescimento durante 3-7 dias. As concentrações de aplicação dos suplementos foram expressas como milionésimos de uma parte de uma concentração de uma reserva por ml (μg/ml).

Ensaio ACE-2 ELISA

Os poços das placas de cultura (poços) da instalação experimental foram lavados duas vezes com solução salina tampão fosfato (PBS) e fixados com 3% de formaldeído/0,5% de Triton X100/PBS durante 1 hora a 4°C e depois lavados quatro vezes com PBS. 200 μL de 1% de albumina de soro bovino (BSA, Sigma) em PBS foi adicionado. A placa foi então incubada de um dia para o outro a 4°C. O anticorpo policlonal anti-ACE-2 do coelho (Sigma) foi adicionado a 100 μl de 1%BSA/PBS durante uma hora e meia de incubação à temperatura ambiente (RT). Após três ciclos de lavagem com 0,1

% BSA/PBS, 100 μL anticorpo de coelho anti-IgG conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP, Sigma) foi adicionado aos poços das placas de cultura durante 1 h à temperatura ambiente (RT). Depois de

três ciclos de lavagem com 0,1%BSA/PBS, a atividade HRP restante foi determinada por incubação com 100 μl de solução de substrato de TMB (Sigma Company) durante 20 min em RT, seguido pela adição de 50 μl de 1N H2SO4 e medição da densidade óptica a 450 nm utilizando um leitor de microplacas (Dispositivos Moleculares). Os resultados são expressos como uma percentagem do controlo experimental sem adições (média +/- SD, n=6). A média do controlo não específico (poços incubados sem anticorpo anti-ACE2) (n=6) foi subtraída de todos os valores da amostra.

Bloqueio de RBD (receptor binding domain) Este ensaio foi realizado utilizando um kit de ensaio de neutralização de vírus de substituição GenScript SARS-CoV-2, que pode detetar anticorpos ou inibidores que bloqueiam a interação entre o receptor binding domain (RBD) da proteína spike viral e o receptor de superfície celular ACE2.

Todas as amostras experimentais com as concentrações indicadas e os controlos positivos e negativos (parte do kit de teste GenScript) foram diluídos com o tampão de diluição da amostra com uma relação de volume de 1:9. Em tubos separados, o RBD conjugado com HRP foi também diluído com o tampão de diluição HRP a uma razão de volume de 1:99.

A reação de ligação/neutralização foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, os controlos positivos e negativos diluídos e as amostras experimentais com as concentrações indicadas foram misturados com a solução de HRP-RBD diluída numa proporção de volume de 1:1 e incubados a 37°C durante 30 minutos. Subsequentemente, 100 µl de cada mistura de controlo positivo, a mistura de controlo negativo e as misturas das amostras de teste foram adicionadas aos poços correspondentes com receptor ACE2 imobilizado e incubadas a 37°C durante 15 minutos. As placas foram então lavadas quatro vezes com 260 µl/bolo da solução de lavagem 1 x e a solução de TMB foi adicionada a cada poço (100 µl/bolo). As placas foram incubadas no escuro à temperatura ambiente durante até 5 minutos. Depois foram adicionados 50 µl/bolo de solução de reserva para atenuar a reação e a absorbância foi imediatamente medida no leitor de placas a 450 nm. A experiência foi realizada três vezes em duplicados. Os valores são dados em % do controlo.

Figura 1:

A. Os coronavírus infetam células do corpo humano através do receptor ACE2.
B. Princípio do ensaio comercialmente disponível utilizado neste estudo para medir a interação entre a proteína de ligação do receptor (RBD) do coronavírus (SARS-CoV-2) e o receptor ACE2 na superfície das células somáticas.

RESULTADOS

Eficácia de uma combinação específica de micronutrientes na expressão do receptor ACE2 nas células epiteliais pulmonares humanas.

A figura 2 mostra os efeitos de diferentes concentrações de uma combinação específica de diferentes compostos vegetais ativos e extratos sobre a formação celular (expressão) dos receptores ACE2 nas células epiteliais humanas das pequenas vias respiratórias (alvéolos).

Figura 2: Eficácia da combinação de micronutrientes na expressão do receptor ACE2 em células pulmonares humanas (células epiteliais alveolares). As alterações na expressão ACE2 são expressas como % de controlo.

Os resultados dos testes mostram uma diminuição na formação do receptor ACE2, dependendo da concentração da combinação de micronutrientes. Na concentração mais elevada de micronutrientes (320 ug/mL), a expressão do receptor celular ACE2 diminuiu em 92 %. Isto indica que, na presença destes micronutrientes, a ligação do vírus aos receptores das células do corpo pode ser significativamente reduzida, uma vez que estes receptores já quase não se formam.

O efeito direto da combinação de micronutrientes sobre o acoplamento do vírus ao receptor ACE2
A interação do local de ligação do vírus (sequência RBD da proteína do pico SARS-CoV-2) ao seu receptor celular é o passo necessário para que o vírus entre nas células do corpo e um pré-requisito para a infeção.

Investigámos a capacidade da combinação descrita de compostos vegetais ativos para inibir esta interação entre o local de ligação da proteína do espigão do SARS-CoV-2 com o receptor humano ACE2. No nosso estudo, utilizámos um sistema de ensaio altamente sensível que estava de acordo com as últimas descobertas científicas. Este sistema pode ser utilizado para detetar moléculas capazes de bloquear a interação do domínio de ligação do receptor (RBD) da proteína spike viral com o receptor ACE2 da célula.

Figura 3: Inibição da encadernação do local de ligação do vírus (domínio de ligação do receptor da proteína spike SARS-CoV-2) à célula receptora ACE2 por combinação específica de micronutrientes. Dados em % de controlo, “controlo de bloqueio” = 100% de inibição de ligação.

A figura 3 mostra que a combinação experimental de produtos vegetais naturais foi capaz de bloquear a ligação do domínio RBD sobre a proteína spike do vírus SARS-CoV-2 ao seu receptor ACE2. Este efeito inibitório era dependente da concentração, causando 97% de inibição de ligação a uma concentração de micronutrientes de 100 µg/mL. Foi observado um efeito significativo da combinação de micronutrientes na inibição da ligação do vírus ao receptor de superfície celular a uma concentração 40 vezes inferior, ou seja, 2,5 µg/mL, onde já foi alcançada uma inibição de ligação de cerca de 20 %.

DISCUSSÃO

Significado dos nossos resultados

Os resultados apresentados neste estudo demonstram que os micronutrientes podem inibir eficazmente mecanismos celulares importantes da infeção por coronavírus.

Estes resultados estão disponíveis num momento crucial em que as comunidades científicas e médicas de todo o mundo procuram desesperadamente medidas eficazes contra a pandemia da COVID-19.

Utilizando métodos científicos e técnicas de ponta empregadas na investigação do coronavírus, demonstrámos que os micronutrientes podem inibir em 97% a interação do sítio de ligação do vírus (RBD da proteína de pico da SARS-CoV-2) e do receptor celular específico (ACE2). Isto significa que os micronutrientes poderiam prevenir quase completamente o risco de infeção viral. Além disso, a mesma composição de micronutrientes inibiu a expressão dos receptores ACE2 nas células pulmonares humanas (células epiteliais alveolares) em até 92 %.

Numa publicação anterior, relatámos que outra combinação de micronutrientes, incluindo vitamina C, aminoácidos, fito-nutrientes e minerais, reduziu significativamente a formação de receptores ACE2. Esta evidência foi obtida a partir de dois tipos de células que são preferencialmente visadas pelo coronavírus – a epinefrina do pulmão humano – as células do sangue e as células endoteliais vasculares humanas.

Outra descoberta importante deste estudo anterior foi que a inibição da formação da ACE2 era ainda mais pronunciada em condições inflamatórias, como ocorre em qualquer infeção viral. Isto significaria que a eficácia dos micronutrientes é ainda mais pronunciada em condições clínicas e em fases avançadas da COVID-19, que se caracterizam por uma inflamação generalizada e por uma chamada “tempestade de citocinas” (aumento explosivo das substâncias de sinalização inflamatória).

Os resultados deste novo estudo sugerem que composições específicas de compostos vegetais biologicamente ativos podem simultaneamente controlar dois mecanismos cruciais que determinam a capacidade do coronavírus para causar infeção.

Luz das nossas descobertas, é particularmente decepcionante que o grande corpo de provas científicas e clínicas que apoiam a eficácia dos micronutrientes em muitos aspetos das infeções virais tenha sido largamente ignorado.^{10, 11, 12, 13}

As provas de que os micronutrientes podem ser a resposta ao coronavírus e outras pandemias devem encorajar os cientistas e os profissionais médicos a esforçarem-se por obter novos conhecimentos a nível mundial sobre o valor terapêutico dos micronutrientes na prevenção de doenças infecciosas.

Implicações destas conclusões para a política de saúde

A escala da atual pandemia e a magnitude do seu impacto na saúde humana, bem como na economia, fazem deste estudo de micronutrientes uma contribuição crítica para o controlo desta pandemia.

Isto é particularmente importante uma vez que todas as outras medidas atualmente em desenvolvimento ou estão associadas a efeitos secundários significativos ou são abordagens terapêuticas novas e não comprovadas. As reações extraordinariamente fortes da comunidade internacional de peritos às primeiras vacinas registadas baseadas em genes virais atestam a consciência dos riscos potenciais associados à introdução de tais terapias inovadoras em toda a população.

Com base nos resultados do nosso estudo, está agora disponível uma abordagem cientificamente testada baseada em micronutrientes como estratégia eficaz – e segura – para combater a atual pandemia. Com uma taxa de bloqueio de quase 100%, os micronutrientes são tão eficazes como qualquer abordagem vacinal – e sem riscos incalculáveis. Além disso, esta abordagem tem outras vantagens fundamentais em termos de controlo das infeções pelo coronavírus, tais como uma diminuição significativa da disponibilidade de “âncoras” virais na superfície das células humanas, bem como um reforço global da função imunitária.

Uma abordagem baseada em micronutrientes também permite que toda a população participe ativamente na prevenção das infeções pelo coronavírus. Esta estratégia baseada em micronutrientes vai assim muito além do uso de máscaras, distanciamento social e outras medidas passivas.

REFERÊNCIAS

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10. Jariwalla RJ, Roomi MW, Gangapurkar B, Kalinovsky T, Niedzwiecki A, Rath M. Suppression of influenza A virus nuclear antigen production and neuraminidase activity by a nutrient mixture containing ascorbic acid, green tea extract and amino acids. 2007; 31(1): 1-15. doi: 10.1002/biof.5520310101
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